Père adoptif de Gamora et Nébula, Thanos a commencé à recueillir les six Pierres d'Infinité : la Pierre du Pouvoir, la Pierre de l'Espace, la Pierre de Réalité, la Pierre de l'Âme, la Pierre du Temps et la Pierre de l'Esprit. Son objectif est de réunir ces six gemmes sur un gantelet doré, forgé par le nain Eitri sur Nidavellir, afin d'utiliser leur immense puissance pour détruire la moitié de la population de l'Univers et rétablir ainsi un certain équilibre. Dans sa quête le menant sur diverses planètes, la Terre, Knowhere et Vormir, Thanos est aidé par ses enfants adoptifs : Ebony Maw (en), Cull Obsidian (en), Corvus Glaive (en) et Proxima Midnight (en). Face à cette nouvelle menace qui concerne l'Univers entier, le groupe de super-héros des Avengers, divisé depuis 2 ans, doit se reformer, et s'associer au Docteur Strange, aux Gardiens de la Galaxie et au peuple du Wakanda.
À la suite des événements en Sokovie1, Steve Rogers forme une nouvelle équipe de super-héros et après un énième incident international, l'ONU fait adopter les Accords de Sokovie 2 avec l'aide de Tony Stark et du Général Ross : désormais les Avengers obéiront à l'ONU et n'interviendront dans un conflit que si l'ONU donne son accord. Ce traité divise les Avengers. Certains, menés par Captain America, refusent parce qu'ils savent que les politiciens de l'ONU utiliseront les Avengers pour servir uniquement leurs intérêts. Les autres, comme Iron Man, pensent que ces accords sont un garde-fou et une nécessité pour éviter les dérives de héros possédant des pouvoirs extrêmement puissants et dangereux. Par ailleurs, Steve Rogers tente d'aider son ami Bucky, impliqué dans de nombreux crimes.
Alors que de nouveaux personnages font leur apparition, tels La Panthère noire et le mystérieux Helmut Zemo, ces accords divisent les Avengers, anciens comme nouveaux, entre d'une part les défenseurs de la liberté et d'autre part les partisans d'un contrôle. L'affrontement entre les deux équipes (d'un côté, Iron Man, Black Widow, Vision, Spider-Man, War-Machine et La Panthère Noire ; de l'autre, Captain America, Wanda Maximoff, le Soldat de l'Hiver, le Faucon, Ant-Man et Hawkeye) est inévitable. Mais qui se cache réellement derrière les incidents qui provoquent ce conflit ?
Deux ans après les événements cataclysmiques qui ont ravagé New York5, Steve Rogers vit désormais à Washington, D.C, où il s'efforce de s'adapter au monde moderne.
Pendant son jogging, Steve rencontre Sam Wilson, un ancien militaire qui occupe un poste administratif et aide les vétérans à se réintégrer. Alors qu'ils sympathisent, Natasha Romanoff arrive et emmène Steve en mission : ils doivent sauver les otages d'un bateau du SHIELD qui a été détourné par George Batroc, un criminel français. Captain America, l'agent Rumlow, Romanoff et leurs hommes se battent contre les pirates et sauvent les otages. Mais il s'avère que Natasha a également accompli une mission secrète du SHIELD : récupérer des données stockées dans un ordinateur sur le navire.
Plus tard, Nick Fury découvre que les données sur la clé USB lui sont inaccessibles. Après avoir été attaqué sur la route et sévèrement blessé, il se rend chez Steve, lui donne la clé USB et lui dit de ne faire confiance à personne. Il prend alors une balle tirée par un tueur mystérieux, que Steve poursuit brièvement avant qu'il ne lui échappe.
Alors que Nick est opéré, Natasha révèle à Steve que l'homme qui a tiré sur Nick est surnommé le Soldat de l'Hiver, mais qu'elle le considérait comme une légende étant donné la difficulté du SHIELD à l'appréhender. Nick décède un moment plus tard, les chirurgiens n'ayant pas réussi à le sauver, et son corps est emmené par Maria Hill.
Le directeur Alexander Pierce, un haut gradé du SHIELD, demande à Steve pour quelle raison Fury se trouvait chez lui. Comme Steve refuse de lui répondre, Pierce le considère comme un traître, et de nombreux agents du SHIELD se lancent à sa poursuite. Il réussit à s'échapper avec Natasha. En analysant les données de la clé USB, ils trouvent un bunker dans le New Jersey, dans lequel se trouve un ordinateur qui a conservé la conscience d'Arnim Zola, le scientifique qui travaillait pour Crâne Rouge pendant la Seconde Guerre Mondiale. Capturé par l'armée américaine avant la fin de Crâne Rouge, il a travaillé pour le SHIELD et a aidé à l'infiltration d'agents de l'HYDRA depuis sa création. Alors que le bunker est détruit par un missile, Steve et Natasha réussissent à s'échapper.
Rejoints par Wilson qui a récupéré un exosquelette lui permettant de voler, le groupe comprend que l'agent Jasper Sitwell est une des taupes de l'HYDRA et l'interrogent. Il leur révèle que grâce à l'esprit de Zola, l'HYDRA a développé un algorithme permettant de repérer toute personne représentant une menace, potentielle ou réelle, pour l'HYDRA, et qu'ils comptent les exterminer grâce aux trois nouveaux héliporteurs du SHIELD, qui sont capables de verrouiller des cibles bien précises. Ils sont ensuite attaqués par le Soldat de l'Hiver et ses hommes ; au cours du combat, Steve parvient à lui retirer son masque et reconnaît Bucky, son ami d'enfance, laissé pour mort lors de la Seconde Guerre Mondiale. Bucky ne reconnaît cependant pas Steve, et s'apprête à le tuer, mais il est neutralisé par Natasha et Sam, avant que le SHIELD n'arrive sur les lieux et ne les arrête tous les trois.
Ils sont cependant exfiltrés par l'agent Maria Hill, qui les mène à Fury (ce dernier avait simulé sa mort). Il s'avère qu'après sa chute dans les montagnes suisses, Bucky avait été récupéré par Zola, qui lui a lavé le cerveau et l'a muni d'un bras cybernétique. Quant à Pierce, il est en réalité à la tête de l'HYDRA. Hill fournit des clés numériques pour désactiver les trois héliporteurs.
Alors que les membres du Conseil de Sécurité Mondiale se rendent au quartier général du SHIELD, Steve diffuse un message pour dévoiler la présence de l'HYDRA dans l'organisation. Le chaos se déclenche alors, et les agents de l'HYDRA combattent alors ceux du SHIELD, dans la confusion la plus complète. Captain America et le Faucon réussissent à désactiver deux héliporteurs, mais le Soldat de l'Hiver détruit l'exosquelette du Faucon et combat Steve sur le troisième. Steve réussit cependant à désactiver le dernier, et l'agent Hill les réoriente les uns sur les autres.
Steve finit par raisonner Bucky et ce dernier le sauve alors que l'héliporteur sombre dans l'océan. Pierce est abattu par Fury. Toujours officiellement mort, Fury décide ensuite de se rendre en Europe de l'Est pour arrêter les derniers agents de l'HYDRA, tandis que Steve et Sam décident de partir à la recherche de Bucky.
Après le générique, on voit le baron Strucker, désormais aux commandes de l'HYDRA, qui a récupéré le sceptre de Loki et qui retient prisonniers Vif-Argent et la sorcière Rouge? À la toute fin, on voit Bucky visiter l'exposition sur Captain America et enfin comprendre le lien qui les unit.